采集先证者及其家系外周血并提取其基因组DNA，对先证者进行全基因外显子组测序，并结合序列变异生物信息学分析方法，鉴定其致病基因，利用Sanger测序对基因突变位点验证。1基因存在由c.1276_1279dupGGAG（p.Asp427fs）移码突变和c.398+5G＞A剪切位点变异组成的复合杂合突变，而其表型正常的父亲为c.1276_1279dupGGAG（p.Asp427fs）杂合突变，表型正常的母亲为c.398+5G＞A杂合突变。1基因c.1276_1279dupGGAG和c.398+5G＞A复合杂合突变导致，此患者被诊断为Hermansky-Pudlak综合征1型。外显子测序技术可以快速准确地筛查白化病候选基因，并明确其具体临床亚型，有利于临床医师积极干预患者潜在并发症以及改善患者质量。
HPS1基因；白化病；Hermansky-Pudlak综合征1型；全外显子组测序白化病是由于黑色素合成或转运相关基因突变所引起的具有相同或相似临床症状的一类遗传病的总称，为一大类异质性很强的隐性遗传的色素缺乏症，全球发病率约1/17 000[1]
[2]。迄今为止，已明确的人类白化病至少有22种亚型，其中包括非综合征型的眼皮肤白化病（oculocutaneous albinism，OCA）l～7型、眼白化病（ocular albinism，OA）型以及综合征型的Hermansky-Pudlak综合征（Hermansky-Pudlak syndrome，HPS）l～10型、Chediak-Higashi综合征、Grieselli综合征l～3型等[3]，每一种白化病亚型均有的致病基因（TYR、OCA2、TYRP1、SLC45A2、SLC24A5、C10orf11、GPR143等）。因此，白化病患者及其家系的遗传学研究可以明确其发病机制以及临床亚型。我们拟通过外显子组测序技术对1个白化病家系进行遗传学研究，探讨其致病的机制。1 材料和方法
患儿，男，4岁，汉族。因双眼畏光流泪就诊于上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心眼科。患儿自幼皮肤发白，毛发皆呈淡。患儿足月剖宫产，无窒息史，出生后有反复呼吸道等感染，碰撞后易发瘀斑。父母非近亲婚配，否认家族中有类似疾病。眼部检查：右眼视力0.5，左眼视力0.4，矫正均不能提高，双眼眼底色素减退，黄斑中心凹发育不良。实验室检查：白细胞 11.2×10
9/L，凝血功能检测正常，血小板聚集功能异常（二磷酸腺苷及肾上腺素聚集消失）。本研究经上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心医学伦理委员会批准，所有基因诊断工作均取得患者家属的同意并签署知情同意书。1.2 方法
1.2.2 全外显子组测序 抽取先证者1 mL全血送至上海天昊生物科技有限公司，使用Hiseq2000测序系统（美国Ilumina公司）进行人类全基因外显子组高通量测序。全外显子组测序后获得的原始数据通过BWA软件进行序列比对，采用GATK和VarScan软件对突变及变异进行识别，包括对单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入和缺失等进行检测、注释和统计分析。利用Annovar软件从外部数据库进行变异位点注释，以评估给定的序列变异的影响。根据数据分析结果，首先考虑白化病相关基因突变并参考dbSNP数据库和HGMD数据库找出致病突变。
2.1.2 全外显子组基因突变结果 先证者全外显子组测序共检出19 836个变异位点，本研究重点关注非同义突变位点、剪切位点突变、插入和缺失突变位点，排除在dbSNP144数据库、1000 Genome Project数据库、Esp6500数据库、HapMap Project数据库等中存在的突变位点，并优先分析已知白化病相关基因突变位点。经过一系列序列变异的生物信息学分析后，发现先证者
HPS1基因变异可引起HPS1型，主要临床特点是眼皮肤白化病，血小板贮藏池缺陷导致出血倾向，呈常染色体隐性方式遗传。2.2 Sanger测序验证结果
目前，已知30多个基因和600多个致病位点突变与白化病有关，其中HPS确定的候选基因有10种。HPS是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，其主要临床特点为眼皮肤白化病及血小板储存池缺陷，可伴肺纤维化、肉芽肿性结肠炎等并发症，发病率约1/500 000～1/1 000 000（波多黎各以外地区）
。根据不同的致病基因以及遗传学背景，HPS可分为10种亚型（HPS1-HPS10），分别由
HPS3-6、DTNBP1、BLOC1S3、BLOC1S6基因分别表达一种异源寡聚合物的亚基，即参与构成溶酶体相关细胞器生物发生复合体（biogenesis of lysosomal organelles complex，BLOC）。BLOC在黑素细胞的黑素颗粒、血小板致密颗粒、T淋巴细胞毒性颗粒、肺泡上皮细胞板层小体等溶酶体相关细胞器的形成中起重要作用[6]，参与构成以胞内体和细胞骨架为连接纽带的蛋白质运输的复杂网络。AP3B1、AP3D1基因分别表达合成接头相关蛋白复合体3（adaptor-related protein complex 3，AP3）的β与δ亚基。AP3参与早期内涵体小室的囊泡萌芽，性识别核内体以及分泌性溶酶体的膜蛋白并分选基序。如AP3可以性识别分选溶酶体相关膜蛋白（lysosome-associated membrane protein，LAMP）-1及LAMP-2至分泌性溶酶体[7]、酪氨酸酶至黑素体[8]、中性粒细胞弹性蛋白酶至嗜中性粒细胞颗粒[1]。因此，HPS1、AP3B1、HPS3-6、DTNBP1、BLOC123、BLOC1S6及AP3D1基因变异可引起BLOC及AP3的蛋白结构与功能改变，从而导致黑素颗粒、血小板致密颗粒、T淋巴细胞毒性颗粒、板层小体的功能缺陷，即发生HPS。HPS
HPS1基因编码的HSP1蛋白含700个氨基酸，构成BLOC3、BLOC4和BLOC5的亚基。目前，HPS数据库已报道31种致病突变，包括错义突变 、移码突变、剪切突变以及无义突变。HPS1型多发于波多黎各地区，患者除具有典型的HPS症状（OCA及出血倾向）外，还可合并肺纤维化和肉芽肿性结肠炎[9]。本研究中患儿的双亲表型正常，但经遗传学检查发现双亲分别携带HPS1基因的c.1276_1279dupGGAG重复变异以及c.398+5G＞A剪切位点变异，均是致病基因的携带者（杂合子），而患儿携带的HPS1基因的2个突变为该致病基因的复合杂合子，出现HPS1表型。VINCENT等[10]在印度人群中也发现2例有明显出血倾向及OCA的HPS1型患者的致病突变为HPS1基因c.398+5G＞A纯合突变，该突变使HPS1基因本跳跃第5外显子并提前终止于第7外显子，相应地，HPS1翻译的蛋白被截短并失去其BLOC亚基功能。先证者的HPS1基因c.1276_1279dupGGAG（p.Asp427fs）为新发现的变异（未在1000 Genomes、HGMD与ExAC等数据库中收录），蛋白继续翻译35个氨基酸后出现终止密码子，导致HPS1蛋白被截断而失去其BLOC亚基功能。基因诊断普遍被国内外专家视为HPS的确诊手段[5]
[10]，基因诊断明确HPS亚型将有利于临床医师积极干预患者潜在并发症，并改善患者质量。本研究中先证者有典型的眼皮肤白化病临床特征，而无肺纤维化、肉芽肿性结肠炎症状，否认白化病家族史，通过全外显子组测序对其家系进行基因分析，发现先证者有HPS1基因c.1276_1278dupGGAG（p.Asp427fs）移码突变和c.398+5G＞A剪切位点变异组成的复合杂合突变，而表型正常的父母分别为这2个突变的携带者。该复合杂合突变为常染色体隐性遗传白化病的致病原因，且这2个突变都使HPS1翻译的蛋白截短并失去其BLOC亚基功能。本研究在基因水平进一步HPS1基因与白化病的相关性，且首次发现并报道c.1276_1279dupGGAG（p.Asp427fs）移码突变的致病性，对研究白化病发病的病理机制具有一定的意义。另外，由于白化病候选致病基因很多，基因型与临床亚型之间又缺乏明确的一一对应关系，传统的Sanger测序筛选致病基因费时费力。本研究采用的全外显子组测序技术彻底改变了罕见单基因病的研究方法，以其高通量和低成本广泛应用于基因诊断，以方便临床确诊。本研究中对先证者白化病所有相关基因突变进行筛查，快速找到突变位点后进行其突变来源父母的验证，大大提高了检测速度，并为临床确诊提供了有力。综上所述，全外显子组测序对白化病诊断和分析具有非常好的临床应用价值，伴随数据生物信息学分析能力的提高以及测序价格的下降，全外显子组测序将成为单基因遗传病诊断的有力筛查工具，为临床诊断、遗传咨询及产前诊断等提供依据。
[4] MIYAMICHI D，ASAHINA M，NAKAJIMA J，et al. Novel HPS6 mutations identified by whole-exome sequencing in two Japanese sisters with suspected ocular albinism [J]. J Hum Genet，2016，61（9）：839-842.
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